サンプルの前処理の重要性
機器分析 (特にクロマトグラフィー分析) におけるサンプルの前処理は、時間がかかり、エラーが発生しやすいステップです。サンプル処理の品質は、クロマトグラフィー分析の最終結果に直接影響します。したがって、分析・定量の効率を向上させるためには、クロマトグラフィー分析における試料前処理法や手法の改善・最適化が重要な課題となっています。一部のサンプルは、タンパク質、油、炭水化物、色素などの成分を含む複雑なマトリックス系に属しているため、複雑なマトリックスのバックグラウンドは、分析対象のターゲット化合物の抽出、分離、精製、定量に大きな問題を引き起こします。したがって、サンプルの前処理は複雑で難しいだけでなく、分析結果の精度、信頼性、感度に決定的な役割を果たします。
サンプルの前処理時間の消費率
LC/MS/MS の高感度機器の場合、マトリックス干渉を軽減し、成分を濃縮するには適切なサンプル前処理が重要です。
サンプル前処理の原理
準備中の成分の化学変化を避けてください。事前に決定されたコンポーネントの汚染を防止および回避します。調製プロセスへの無関係な化合物の導入を最小限に抑える。そしてそれをできるだけシンプルかつ簡単にします。
サンプルの前処理の目的
粒子を除去します。干渉する不純物を減らす。微量成分を濃縮する。検出感度と選択性を向上させます。分離効果を向上させます。クロマトグラフィーのカラムと機器を保護します。溶剤の交換。
サンプル前処理の開発動向
▶一般的な試料の前処理には以下のようなものがあります。 分解法：試料を酸、酸化剤、触媒などとともに還流装置または密閉装置内に置き、加熱して有機物を分解・破壊する方法。湿式消化法
1. 硝酸分解法（透明な水溶液サンプルの場合） 2. 硝酸・過塩素酸分解法（難酸化有機物を含むサンプルの分解） 3. 硝酸・硫酸分解法（硝酸：硫酸）=5:2、多くの場合、少量の過酸化水素を追加します) 4. 硫酸-リン酸消化法 (測定中の Fe3+ イオン) 5. 硫酸 - 過マンガン酸カリウム消化法 (水銀の水溶液サンプルの測定に一般的に使用されます) 6. 硝酸 - 過酸化水素消化法: 生物由来製品を消化するためにこの方法を使用する人もいます。窒素、リン、カリウム、ホウ素、ヒ素、フッ素、その他の元素を測定します。 7. 多成分分解法: 3 つ以上の酸または酸化剤消化システムが必要です。乾式灰法（高温分解法）
1. 灰法は、試料を分解するための化学試薬を使用しないか、使用する量が少量であり、大量の計量試料を処理できるため、微量元素の定量精度の向上に有利です。 2. アッシング温度は一般に 450-550 度であり、揮発性成分を含むサンプルの処理には適しておらず、アッシング時間も比較的長くなります。 3. サンプルの種類と測定する成分の特性に応じて、異なるるつぼとアッシング温度が選択されます。一般的に使用されるるつぼは、石英、白金、銀、ニッケル、鉄、磁器、ポリテトラフルオロエチレンなどです。原理は、るつぼがサンプルと反応せず、処理温度で安定していることです。 4. 通常、アッシング生体サンプルには他の試薬は添加されませんが、分解を促進し、特定の元素の揮発損失を抑制するために、適量の補助アッシング剤が添加されることがよくあります。試料を完全に灰化した後、希硝酸または塩酸に溶解して分析・測定します。
Conventional pretreatment methods Extraction and enrichment 1. Extraction method 1. Oscillation extraction method (vegetables, fruits, grains) 2. Tissue crushing extraction (extracting organic pollutants from animal and plant tissues) 3. Soxhlet extraction (commonly used to extract organic pollutants such as pesticides, petroleum, phenylhydrazine and pyrene from biological and soil samples) 2. Volatilization and evaporation concentration The volatile separation method uses the high volatility of certain components or converts the components to be measured into volatile substances, and then uses inert gas to take them out to achieve the purpose of separation. Evaporation concentration refers to heating the water sample on a hot plate or in a water bath to slowly evaporate the water, so as to reduce the volume of the water sample and concentrate the components to be measured. 3. Distillation method uses the different boiling points of the components of the water sample to separate them from each other; when determining volatile phenols, cyanides, and fluorides in water samples, they must first be pre-distilled and separated in an acidic medium; distillation has three functions: digestion, enrichment, and separation. 4. Ion exchange method uses ion exchangers to exchange reactions with ions in the solution for separation. Ion exchangers can be divided into inorganic ion exchangers and organic ion exchangers (ion exchange resins). ㈤ Coprecipitation method: The phenomenon that a poorly soluble compound in a solution carries out certain coexisting trace components in the process of forming a precipitate. The principle of coprecipitation is based on surface adsorption, the formation of mixed crystals, the interaction and inclusion of heteroelectron nuclei colloidal substances, etc. 1. Coprecipitation separation using adsorption: Common carriers include Fe (OH) 3, Al (OH) 3, Mn (OH) 2 and sulfides, etc. 2. Coprecipitation separation using the formation of mixed crystals 3. Coprecipitation separation using organic coprecipitants ㈥ Adsorption method: Use porous solid adsorbents to adsorb one or several components in the water sample on the surface to achieve the purpose of separation. Commonly used adsorbents include activated carbon, alumina, molecular sieves, large mesh resins, etc. The polluted components adsorbed and enriched on the surface of the adsorbent can be desorbed by organic solvents or heated for determination. ㈦ Chromatography Chromatography is divided into column chromatography, thin layer chromatography, paper chromatography, etc., and adsorbents are divided into inorganic adsorbents and organic adsorbents. ㈧ Sulfonation and saponification Sulfonation: The interfering substances such as fats and waxes in the extract can undergo sulfonation reaction with concentrated sulfuric acid to generate highly polar sulfonic acid compounds, which are separated from the pesticides in the extract as the sulfuric acid layer separates. The sulfonation method uses the saponification reaction of oils and fats with strong alkali to generate fatty acid salts and separate them. ㈨ Low-temperature freezing method is based on the principle that the solubility of different substances in the same solvent varies with temperature to separate them from each other. ㈩ Principle of extraction: The distribution coefficient of substances in different solvent phases is different, so as to achieve the separation and enrichment of components. Types of conventional liquid-liquid extraction Extraction of organic substances: Organic substances separated in the aqueous phase are easily extracted by organic solvents Extraction of inorganic substances: First, a reagent is added to combine with the ionic components in the aqueous phase to generate a substance that is uncharged and easily soluble in organic solvents. The reagent, organic phase, and aqueous phase together form an extraction system. According to the different types of extractables generated, it can be divided into chelate extraction system, ion-association complex extraction system, ternary complex extraction system, and synergistic extraction system. Overview of solid phase extraction (SPE) It is developed by combining liquid-solid extraction and column liquid chromatography technology. SPE is a column chromatography separation process, which has many similarities with high performance liquid chromatography (HLPC) in terms of separation mechanism, stationary phase and solvent selection. The particle size of SPE filler (>40μm）はHLPC（3-10μm）よりも大きいです。したがって、SPE は、保持特性が大きく異なる化合物を分離するためにのみ使用できます。分離効率の低い SPE テクノロジーは、主にサンプルの処理に使用されます。 SPE の目的は、その後の分析を妨げる物質をサンプルから除去することです。微量成分を豊富にし、分析感度を向上させます。分析方法に合わせてサンプル溶媒を変更します。その場での誘導体化。サンプルの脱塩。サンプルの保管と輸送が容易になります。取り付け SPE カラム: HLPC カラムフィラーとはフィラーの粒子サイズが異なりますが、その他は同じです。最もよく使用されるのは C18 相です。このタイプの充填剤は疎水性が高く、水相中のほとんどの有機物を保持します。異なる選択性と保持特性を持つ他の材料も使用されます。活性基を含む、または活性化合物でコーティングされた SPE 相を使用して、誘導体化反応を分析できます。 SPE ディスク: メンブレンフィルターに非常に似ています。ディスクエクストラクターは、フィラーを含む PTFE ディスク、またはフィラーを充填したガラス繊維シートです。フィラーは SPE ディスク全体の約 60% ～ 90% を占め、ディスクの厚さは約 1mm です。前者との違いはベッドの厚みと直径（L/d）の比です。水からの微量汚染物質の濃縮に適しています。固相マイクロ抽出 (SPME) オフラインおよびオンライン SPE オフライン SPE 1. SPE と分析は独立して実行され、SPE はその後の分析に適したサンプルのみを提供します。 2. サンプル溶液と充填剤の間の十分な接触を確保するために、溶媒流量が多すぎてはなりません。 3. 自動化された機器によって完了することができます。自動 SPE 装置は、カラム ラック、プランジャー ポンプ、液体リザーバー、パイプライン、サンプル プロセッサーで構成されます。オンライン SPE はオンライン精製および濃縮技術としても知られており、主に HLPC 分析 SPE 法の確立に使用されます。 カラム前処理の目的: 1. 充填剤に存在する可能性のある不純物を除去します。 2. 充填剤を溶媒化し、固相抽出の再現性を向上させます。 サンプル添加 1. 分析物の損失を防ぐために、サンプル溶媒の濃度が高すぎてはなりません。 2. 逆相機構で抽出する場合、溶媒として水または緩衝液が使用され、有機溶媒の量は 10% (V/V) を超えません。 3. サンプル添加中の分析物の損失を克服するには、弱溶媒を使用してサンプルを希釈し、サンプル量を減らし、SPE カラム内の充填剤の量を増やし、分析物を強力に保持する吸着剤を選択します。分析物の溶出と収集 (分析物がカラムを通過する間に不純物が保持される場合もあります) (固体分散媒を使用した固相抽出) 1. 逆相抽出カラムの洗浄溶媒は、水または適切な濃度の有機物を含む緩衝液です。溶媒; 2. 洗浄溶媒の最適な濃度と量を決定するには、SPE カラムにサンプルを加え、SPE カラムベッドの 5 ～ 10 倍の量で洗浄し、流出液を収集して順番に分析し、溶出プロファイルを取得します。検体の洗浄溶媒の量。洗浄溶剤の強度を順番に上げ、さまざまな強度での分析物の溶出プロファイルに従って、洗浄溶剤の適切な強度と量を決定します。 3. 溶出と収集の目的: SPE カラム上の分析物よりも強く保持される不純物をできるだけ多く保持しながら、分析物を完全に溶出して最小体積分率で収集すること。 4. 検体の濃度を高めたり、その後の分析のために溶媒の特性を調整したりするには、収集した検体画分を窒素でブロー乾燥し、少量の溶媒に溶解します。 SPE 環境分析の応用 1. 地表水などの環境サンプル中の分析物の濃度は非常に低いため、分析前に分析物を濃縮する必要があります。 2. 体液の組成は複雑で、大量のタンパク質が含まれています。分析の前に、サンプルを前処理してタンパク質を除去する必要があります。薬物分析 臨床分析 食品および飲料分析 固相マイクロ抽出 (SPME) 固相マイクロ抽出は、「サンプリング、抽出、濃縮、注入」を統合しており、ガスクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーと組み合わせてサンプルの前処理技術として使用できます。固相マイクロ抽出理論 平衡理論: 吸着プロセス中、吸着平衡は固相と液相または気相の間に確立されます。物質移動プロセスが遅いため、一定の時間内では完全には平衡に達しません。コーティング材料抽出の選択性は主にコーティング材料の性能に依存します。分析物は同様の極性を持つ固相によって容易に抽出されるという原理に従って、適切な SPE コーティングが選択されます。固相コーティングに最も一般的に使用される物質はポリメチルシロキサン (PDMS) とポリアクリレート (PA) で、どちらもガスクロマトグラフィーと液体クロマトグラフィーに使用できます。前者は揮発性化合物、多環芳香族炭化水素、芳香族炭化水素などの非極性化合物に主に使用され、後者はトリアジンやフェノール化合物などの極性化合物に主に使用されます。固相層は、非結合形態、結合形態、または部分的に架橋した形態で石英繊維上にコーティングすることができる。コーティングにポリマーを追加すると、コーティングの表面積が増加し、SPME の効率が向上します。 1. ポリジメチルシロキサン-ジビニルベンゼン (PDMS-DVB)、芳香族炭化水素および揮発性化合物に使用されます。 2. ポリエチレングリコール-ジビニルベンゼン (CW-DVB)。アルコールなどの極性化合物に使用されます。 3. イオン化界面活性剤に使用されるポリエチレングリコールテンプレート樹脂 (CW-TPR) 4. グラファイトカーボンブラックでコーティングされた石英繊維。水および空気中の微量汚染物質の分析に使用されます。 5. カーボンナノチューブおよび二酸化チタンナノチューブ法の確立 1. サンプリング条件の一貫性を維持する。 2. サンプリングに影響を与える要因には、サンプリング時間、温度、ファイバーの深さなどが含まれます。 3. 応答値と分析物の初期濃度との間の線形関係を維持します。抽出が吸着等温線の直線範囲内になるように、サンプル濃度が高すぎたり、サンプル量が少なすぎたりすることはできません。 4. サンプルに電解質を添加すると、溶液のイオン強度が増加し、それによって検体の溶解度が低下し、抽出効率が向上します。サンプルの pH を変更すると、酸性物質とアルカリ性物質の抽出率に大きな影響を与えます。注: マイクロ抽出における塩の添加の効果は、従来の液液抽出の効果とは異なる場合があるため、実験条件を最適化する必要があります。 5. かき混ぜることで抽出時間を短縮できます。マイクロ波抽出 (MAE) マイクロ波抽出は、抽出時間が短く、選択性が高く、回収率が高く、試薬の使用量が少なく、汚染が少なく、水を抽出剤として使用でき、サンプル前処理条件を自動的に制御できます。用途は少なく、現在は多環芳香族炭化水素、残留農薬、有機金属化合物、植物中の有効成分、有害物質、鉱物中の金属、血液中の薬物、生体サンプル中の残留農薬の抽出に使用されています。マイクロ波抽出法の原理と特徴 マイクロ波（水、エタノール、酸、アルカリ、塩）を吸収する マイクロ波抽出効率の高さ： 1. 分離物質にマイクロ波を直接作用させる。 2. マイクロ波抽出では、非極性溶媒より極性溶媒を使用する方が有利です。 3. 密閉容器の採用により、溶媒の沸点をはるかに上回る温度でマイクロ波抽出が可能となり、マイクロ波抽出効率が大幅に向上 マイクロ波を反射（金属物質） マイクロ波を透過（無極性物質） マイクロ波抽出装置と方法（主な構成要素は、さまざまな要件に応じて装備された特別に製造されたマイクロ波加熱装置、抽出容器、圧力および温度制御装置です） マルチキャビティ 2450MHz：一度に複数のサンプルを調製でき、抽出の制御が容易です条件に適しており、抽出は高速です。従来のマイクロ波抽出法：極性溶媒、または極性溶媒と非極性溶媒の混合物と抽出サンプルを混合し、マイクロ波サンプル調製容器に入れ、密閉状態のマイクロ波サンプル調製システム内で加熱します。抽出成分の要件に応じて抽出圧力または温度と時間を制御します。加熱の終了時にサンプルを濾過し、濾液を直接測定するか、または対応する処理後に測定します。マイクロ波抽出の加熱時間は通常5～10分程度です。抽出溶媒とサンプルの合計量は、サンプル調製カップの容量の 1/3 を超えてはなりません。シングルモードフォーカシング 2450MHz: 圧力と温度の制御が不要で、サンプル調製量が多く、一度に 1 つのサンプルしか調製できず、抽出時間が長くなります。超臨界流体抽出 (SCF)
超臨界流体 (SCF) は、温度と圧力の両方が臨界点よりも高い流体です。その特徴は、 1. 拡散係数が気体より小さいが、液体よりは一桁大きい。 2. 粘度が気体に近い。 3. その密度は液体の密度に似ており、圧力のわずかな変化により密度が大幅に変化する可能性があります。 4. 圧力または温度の変化により、相変化が生じる可能性があります。基本原理 超臨界状態では、超臨界流体が分離対象物質と接触することにより、極性、沸点、相対分子量の成分が順に選択的に抽出され、超臨界流体の密度と誘電率が増加します。密閉系の圧力が増加すると、極性が増加します。プログラムブーストを使用することで、異なる極性の成分を段階的に抽出できます。超臨界 CO2 の溶解度: 1. 親油性成分と低沸点成分は低圧 (104kPa) で抽出できます。 2. 化合物の極性基が多いほど、抽出が難しくなります。 3. 化合物の相対分子量が大きくなるほど、抽出は難しくなります。モディファイア CO2 は非極性溶媒ですが、一般に極性溶媒は CO2 への溶解性を高めるために添加されるため、モディファイアと呼ばれます。より一般的に使用されるのは、メタノール、アセトン、エタノール、酢酸エチルなどです。変性剤の効果は限られています。超臨界流体の溶解度が変化すると、抽出システムの捕捉効果も弱まり、その結果共抽出物が増加し、分析的測定に支障をきたす可能性があります。使用する改質剤の量は少量である必要があり、通常は 5% を超えてはなりません。超臨界流体抽出技術の応用は、天然物質の抽出に大きな利点をもたらします。 GC、IR、MS、LC などと組み合わせて使用すると、効率的な分析方法になります。
